現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但

是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。

1、正相色譜

正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)

(NH2,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。

由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品

中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份*先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿

（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene  Chloride）等。

2、反相色譜

反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團(tuán)的鍵合相。

反相色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合*先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有

更強(qiáng)的保留。

常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。

二、聚合物填料

聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點是在PH值為1～

14均可使用。

相對與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白

質(zhì)等樣品的分離非常有效。

現(xiàn)在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。

三、其他無機(jī)填料

其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般**于特殊的

用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基

鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基

鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由

于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，

氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在PH高達(dá)12的流動相中使用。

但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，

新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)

用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難

度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。

怎樣選擇填料粒度

目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、

5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填

充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，

但不是**的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料

是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，

3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更

短的色譜柱，以縮短分析時間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使

用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

一、如何保證良好的柱性能與柱壽命

◆ 認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書；

◆ 使用填充良好的色譜柱；

◆ 盡量減少壓力波動，避免機(jī)械及熱沖擊；

◆ 使用保護(hù)柱及在線過濾器；

◆ 經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；

◆ 充分過濾樣品及流動相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；

◆ 用穩(wěn)定的固定相（C18*穩(wěn)定）；

◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機(jī)緩沖溶液；

◆ 色譜柱使用溫度*好小于40℃；

◆ 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0；

◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；

◆ 流動相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；

◆ 過夜或貯存時，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動相保存（乙晴*好）。

HPLC固定相及應(yīng)用范圍

名稱    別名      功能基團(tuán)   正相  反相  離子對  應(yīng)用
 
Silica                     -OH           √                         非極性和中等極性以及非離子性有機(jī)化合物。
 
SAS   C1             -(CH3)3               √                在所有的烷基鍵合相中對非極性化合物保留*

                                       弱，典型用于中等極性和多官能團(tuán)化合物.
 
Butyl  C4              -C4H9                 √    √       分離肽和蛋白質(zhì)，保留時間比C8和C18短。
 
MOS  C8，         -C8H17                 √     √      中等極性相中對中等化合物，小肽和蛋白質(zhì)，

          Octyl                                                           極**族化合物和環(huán)境樣品。
 
ODS  C18            -C18H37              √     √       烷基鍵合相中對中等極性化合物保留*強(qiáng)。廣

                                       泛用于**，甾族化合物，脂肪酸和環(huán)境樣品.
 
CPS   CN ,Cyano  -(CH2)3CN      √    √          對極性化合物有獨特的選擇性，適合應(yīng)用于正相

(propyl                                                       分離，當(dāng)用于反相系統(tǒng)時，其選擇性與  C8和

Nitrile)                                                       C18不同，在藥學(xué)領(lǐng)域和復(fù)雜混合物的分離中應(yīng)

                                用廣泛。
 
APS  NH2            -(CH2)3 NH2     √    √         反相中分析糖類和其他極性化合物。弱陰離子交

         (AminoPropyl)                                              換 ，陰離子和有機(jī)酸則應(yīng)用緩沖劑和有機(jī)改性

                                       劑 做流動相。正相中與硅膠的選擇性機(jī)改性劑

                                       不同,分析芳香族效果很好。
 
Phenyl                    -(CH3)C6H5             √     √  芳香族化合物
 
Diol                        -(CH2)2O      √     √      反相時，分離肽和蛋白質(zhì)。正相時，與硅選擇

                              CH2(CH2OH)2                                性 相似,但極性較弱。
 
SCX  強(qiáng)陽離子    -(CH2)2C6H4SO3H-            √  有機(jī)堿

交換
 
SAX  強(qiáng)陰離子     -(CH2)3N+(CH3)3　　　　　　 有機(jī)酸，核苷和核苷酸

交換